La disfuncioncionalidad de las proteínas cftr en macrófagos humanos afecta su actividad bactericida frente a pseudomona
Objetivo:
Detectar defectos intrínsecos en macrófagos respecto a las CFTR a partir de su diferenciación desde monocitos periféricos humanos
– Macrófagos in vitro
– Actividad bactericida
Estructura de CFTR
- La proteína CFTR está formada por 1480 aminoácidos. Pertenece a la familia de las proteínas ABC
- Existe homología entre la estructura primaria de la proteína CFTR y miembros de familias de proteínas de membrana, como la familia de los transportadores ABC, responsables del transporte activo de sustratos a través de la membrana celular, en el que la hidrólisis del ATP es la fuente de energía.
- Esta proteína está formada por dos subunidades repetidas, compuestas cada una por un dominio hidrofílico que atraviesa la membrana (MSD) Ambas subunidades se encuentran unidas por un dominio citoplasmático (dominio R)
- NBD1 y NBD2 son dos regiones de unión para ATP
- CFTR canal de Cl- dependiente AMPc. Multifuncional: canales de Na+, K+, transporte ATP…
Fibrosis quística
- Genética
- Deshidratación vías respiratorias y secreción elevada y viscosa de mucus
- Fallo respiratorio
- Inflamación: internalización de P.aeruginosa
CFTR
- 12 muestras de sangre
- Extracción RNA macrófagos mediante RT-PCR. Monocitos parentales -> Control
- Inmunofluorescencia anticuerpo anti-CFTR H-182 y Alexa fluor-594 goat anti-rabbit para localizar CFTR en macrófagos y lisosomas
- Patch-clamp
- Ensayo bactericida
- Canales en condiciones normales n=9 mV
- Canales respondiendo a una solución de AMPc n=16 mV
- Canales bloqueados por el inhibidor CFTR inh-172 n=7 mV
Resultados
- Macrófagos in vitro expresan CFTR: RT-PCR e inmunofluorescencia en membranas y citosol (FQ)
- Capacidad fagocítica similar (actividad bactericida)
- t2 y t4: rápido descenso UFC en macrófagos sanos y menor grado de eliminación en macrófagos FQ.
Conclusiones
- Inmunofluorescencia: mayor presencia en citoplasma en FQ debido a mal plegamiento CFTR y posterior eliminación
- Macrófagos sanos implica un aumento de [CFTR] MEMBRANA PLASMÁTICA
- Presentes además en fagosomas, lisosomas (vesículas LAMP-1) y otros compartimentos
Correlaciones clínicas para FQ:
– Positiva entre persistencia a la infección de P.aeruginosa y mal pronóstico para el paciente
– Adaptación del patógeno a los pulmones FQ → cambios metabólicos (disminución consumición O2 y un incremento en el uso de NO3-), menor motilidad bacteriana y susceptibilidad antibióticos.
- La inflamación crónica del pulmón como consecuencia de la persistencia de una infección bacteriana por varios patógenos oportunistas, representan la principal causa de mortalidad y morbilidad en los enfermos de fibrosis quística. Los mecanismos que llevan a incrementar la susceptibilidad a las infecciones bacterianas en la fibrosis quística no son conocidos por completo, aunque recientemente está emergiendo con fuerza la importancia de la participación del regulador de conductancia de transmembrana CFTR, proteína transportadora de la familia ABC que actúa como un canal de Cl– dependiente de AMPc, en la funcionalidad de los macrófagos de las personas afectadas por la enfermedad. Aquí es donde los autores observaron la contribución de CFTR en la actividad bactericida contra Pseudomona aeruginosa.
- El objetivo era verificar la expresión de CFTR y su función en donantes sanos y evaluar los macrófagos infectados con fibrosis quística para eliminar Pseudomona aeruginosa. A partir de 12 muestras de sangre, se emplearon los siguientes métodos: extracciones del RNA mediante RT-PCR, inmunofluorescencia con el anticuerpo 2º Alexa fluor-594 goat anti-rabbit para localizar CFTR en (macrófagos y lisosomas), patch-clamp y por último un ensayo bactericida. Los resultados demuestran que los macrófagos de los afectados no difieren en la actividad fagocitaria cuando son infectados por P. aeruginosa, y el porcentaje de supervivencia bacteriano era significativamente mayor en células afectadas. A pesar de ello, los macrófagos afectados seguían disponiendo de una actividad fagocitaria, pero menor respecto a la de macrófagos sanos. Estos resultados apoyan aún más el papel de CFTR en las funciones fundamentales en células inmune, incluyendo la erradicación de infecciones bacterianas por los macrófagos.